目前珍珠牡蛎移植后的免疫排斥反应会增加死亡率，尤其是在不同物种间的移植，且不同物种的异体免疫排斥程度差异很大。究竟是什么导致了珍珠牡蛎异体移植的排斥反应差异如此显著，值得深入研究。
北部湾大学等机构在《Aquaculture》期刊发布题为"Molecular mechanisms of immune rejection against xenotransplantation in the pearl oyster Pinctada fucata revealed by serum proteomics"的文章，利用血清蛋白质组学报道了关于珍珠牡蛎移植的免疫排斥分子机制。
研究背景
海洋珍珠养殖产业在北部湾具有重要经济地位，Pinctada fucata(P. fucata)是主要的海水珍珠养殖物种。目前的大规模珍珠生产方法包括将供体珍珠牡蛎的外套膜移植物和核体人工植入受体珍珠贝中。尽管Pinctada. fucata的珍珠养殖技术较为成熟，但其产生的珍珠层较薄，限制了经济价值。且目前珍珠贝移植后的免疫排斥反应会显著组织的排斥和死亡率，尤其是在不同物种间的移植时，但不同物种之间的免疫排斥程度差异很大。为了研究是什么导致了珍珠牡蛎移植的免疫排斥反应如此显着差异，作者对取了珍珠牡蛎（Pinctada fucata）的同种移植（P. fucata autaritam ottes外套膜片）和异种移植（Pinctada maxima、Pinctada margaritifera、Pteria penguin和Balbass Haliotis diversicolor 的外套膜片段），及没做过手术的Pinctada fucata（Con） 和做了手术了的Pinctada fucata（Op）后的血淋巴，经离心后做血清蛋白质组，以研究免疫排斥的相关分子机制。
研究方法：血清蛋白质组学、PRM
主要结果
珍珠牡蛎接受嫁接后的不同时间死亡率不同
作者对通过对珍珠牡蛎嫁接后的早期死亡率分析，发现嫁接后12 h的死亡率(3.83%)较6 h有显著提高，移植后24h死亡率最高(8%)，48h死亡率次之(7%)。随着时间的推移，移植后珍珠牡蛎的死亡率逐渐减轻。此外，在统计分析用不同的珍珠牡蛎嫁接的死亡率时，发现Pm组死亡率最高(45%)，其次是Ab组(39%)，说明这两组的免疫排斥反应最强（图B），在Con组也观察到少量的死亡率(2%)，这可能是由于采珠过程中的机体损伤导致的死亡。
通过LC-MS/MS鉴定了2127种蛋白质，其中825个蛋白质达到了定量显著性。各组各蛋白的表达情况为图D，三个LC-MS/MS重复之间的高相关性支持了结果的代表性(图C)。PCA结果显示，同一组样本聚类紧密，而不同组的样本聚类明显（图E）。
因为软体动物有一个开放的循环系统，他们所有的组织都浸在血淋巴里。因此，在移植过程中，代谢物、降解成分和一些免疫相关因子都可能进入血淋巴。为了消除这些移植源性蛋白的影响，有必要鉴定在Con、Op和Pf组中不表达，但在异种移植组中特异性表达的蛋白(Pm、Pg、Pp、Ab)。作者的研究发现345个蛋白在Con和Op组中未表达，但在移植实验组中表达。其中，有220种蛋白在Pf组中未表达，但在异种移植组中存在。这些蛋白仅在异种移植组中存在，而在对照组和阴性对照组中不存在，它们更有可能来自供体套膜组织。
该研究中使用的比较蛋白质组学方法避免了对移植源蛋白的潜在分析。此外，血清中的许多蛋白质丰度极低。即使移植源蛋白进入受体珍珠牡蛎血清，它们的低丰度也可能妨碍它们的定量，这也解释了为什么尽管在这项研究中发现了2000多种蛋白质，但只有825种具有可量化的意义。因此，该研究中设置的对照组和阴性对照组最大限度地减少了移植源蛋白污染的可能性，因为研究中分析的蛋白质在这两个非移植对照组中都存在。图F为移植24小时后各组血清蛋白的变化，从图上可以看到，在同种异体移植组(Pf)中，与Op组相比，除Pp组外，异种移植组中DEPs (Pm, Pg和Ab)的数量均显著高于Op组，这说明在珍珠牡蛎移植早期，异种移植体的免疫排斥反应强度大于同种移植体。此外，在Op_vs_Con对照组中，DEPs表现出最高的值，这表明组织损伤引发的免疫反应对核植入后的珍珠牡蛎仍然是一个重要的挑战。在Op_vs_Con对照组中，上调的蛋白计数明显低于下调的蛋白计数。相反，在各个移植对照组(Pf_vs_Op、Pm_vs_Op、Pp_vs_Op、Pg_vs_Op、Ab_v-s_Op)中，情况恰恰相反。这表明组织移植诱导的珍珠牡蛎免疫反应与组织损伤引起的免疫反应明显不同，移植的组织改变了珍珠牡蛎原有的免疫反应过程，可能与移植过程中引发的免疫排斥反应有关，DEPs的这些变化也可能与免疫排斥相关的信号通路有关。
为了了解同种异体移植和异种移植在珍珠牡蛎体内诱导的免疫差异，作者对各组DEPs进行KEGG途径富集分析，结果表明Pf_vs_Op、Pm_vs_Op和Pg_vs_Op组中DEPs的表达模式相似，三组中KEGG通路富集程度最高的是核糖体。此外，ECM-受体相互作用，Focal adhesion和PI3K-Akt信号通路在这三组中也显著富集，而在Op_vs_Con、Pp_vs_Op和Ab_vs_Op等组中，核糖体、Focal adhesion和不同环境下的微生物代谢途径分别是最显著富集的途径。
为了更好地理解移植引起的免疫排斥机制，作者从Pf组和Pm组的上调蛋白中提取了常见的免疫相关调控通路，并筛选了75个交叉蛋白(图A)。进一步的KEGG途径富集分析(图B)表明，富集的途径包括核糖体、吸收、ECM-受体相互作用、蛋白质消化和吸收以及Focal adhesion，与上述结果一致。ECM-受体相互作用和Focal adhesion信号通路已被证实与细胞外基质(ECM)的形成和免疫细胞的迁移有关。这两种途径中涉及的蛋白包括Laminin subunit beta-1 (LAMB1, P02469), Laminin subunit alpha-5 (LAMA5,Q61001), Collagen alpha-3(VI) chain (COL6A3, P15989), Collagen alpha-5(IV) chain (COL4A5, P29400), Filamin-A (FLNA, Q8BTM8),Collagen alpha-1(XIII) chain (Col13a1, Q9R1N9), Nidogen-2 (NID-2,B5DFC9), Fibrillin-1 (FBN1, P35555), Src substrate cortactin (CTTN,Q66HL2), and Collagen alpha-1(III) chain (Col3a1, P08121)。PPI预测蛋白质相互作用如图C所示，为了证实移植是否会导致Lama5蛋白水平升高，作者检测了各组Lama5蛋白水平，结果显示，除了Pp组Lama5蛋白水平显著下调外，同种异体移植组(Pf)和异种移植组(Pm, Pg, Ab) Lama5蛋白水平均显著上调（图D）。
考虑到各组间DEPs交点代表不同移植物引起的变化，作者初步对Pf_vs_Op、Pm_vs_Op、Pm_vs_Pf组进行了相应筛选。作者量化了三个对照组中30个相交蛋白的蛋白水平，并以热图的形式呈现。Scavenger receptor cysteine-rich domain superfamily protein(F7J220), Calreticulin(P28491), and Heat shock protein HSP 90-alpha(Q4R4P1) 在Op组中高表达。Vitellogenin (Q6RG02), Regucalcin (Q6TLF6),Yolk ferritin (P42578), and DNA repair protein RAD52 homolog(P43352) 等在Pf组中高表达。LIM和SH3 domain protein Lasp (Q8I7C3), 40S ribosomal protein S18 (Q8IT98),Histone H4 (P62795), and Paxillin (Q8VI36)在Pm组中高表达。
与同种异体移植物相比，异种移植物通常会引起更严重的免疫排斥反应。分析两者之间的差异可以深入了解异种移植物免疫反应增强的潜在原因。分析异体移植物和异种移植物中上调和下调的DEPs的交叉关系，结果显示异种移植物仅上调了一种DEP，为hsp90-α(HSP90AA1, Q4R4P1)(图A, C)，下调了9种DEPs，包括apha-crystallin B chain Cryab, P02511), Collagen Alpha−1(III) chain(Col3a1, P08121), Yolk ferritin (P42578), Glutathione S−Transferase 1(GST1, P46436), Xanthine dehydrogenase/oxidase (XDH,P47990),Retrograde protein of 51 kDa(RGP51, Q6QUW1),Vitellogenin(Q6RG02), Fibrinogen−like protein 1 (Fgl1, Q71KU9), 和CollagenAlpha−1(XIII) chain (Col13a1, Q9R1N9)（图B,C)。这10个DEP的PPI见图D。
为了验证蛋白质组学数据的准确性，将LAMA5、EIF5A、ACTB和HSP90AA1四种蛋白质的蛋白质组学数据与PRM数据的比较。结果显示这两种方法获得的蛋白质表达模式是一致的，表明从蛋白质组学获得的表达数据具有足够的可靠性和可重复性。
