光合作用是地球上大多数生命能量的基础，它在植物细胞中的叶绿体进行。叶绿体是双层膜结构的细胞器，内部包含许多由核基因组和叶绿体基因组编码的蛋白质。这些蛋白质的维护需要内部叶绿体蛋白酶的作用，而核质溶胶中的泛素-蛋白酶体系统（UPS）在此过程中的作用之前并未被研究。
中国科学院分子植物科学卓越创新中心在《Science advances》期刊发布题为"Ubiquitin-based pathway acts inside chloroplasts to regulate photosynthesis"的文章，通过蛋白质组、泛素化蛋白质组及代谢组发现了一个称为CHLORAD的新途径，它揭示了叶绿体外部膜蛋白的降解实际上涉及UPS的参与。
研究背景
叶绿体是植物细胞中进行光合作用的主要场所，是一种双层膜结构的细胞器。它们起源于内共生事件，由类似于现代蓝藻的细菌演化而来。除了光合作用，叶绿体还参与植物激素的合成、脂肪酸代谢等多种生物学过程。叶绿体的功能依赖于其内部蛋白质的平衡，这些蛋白质大多数是由核基因编码并在细胞质中合成的，然后被导入叶绿体内部。叶绿体内部的蛋白质降解对于维持蛋白质稳态至关重要，这涉及到多种内部蛋白酶。泛素-蛋白酶体系统（UPS）是一种蛋白质降解途径，它通过泛素标记目标蛋白，使其被26S蛋白酶体识别和降解。在植物细胞中，UPS主要在细胞质中发挥作用，而叶绿体作为一个相对独立的细胞器，其内部蛋白降解机制一直被认为是由内部蛋白酶系统独立完成的。了解叶绿体内部蛋白的降解机制对于揭示植物如何适应环境变化、调节光合作用效率以及控制叶绿体的生物合成和降解具有重要意义。这项研究旨在探索叶绿体内部蛋白是否也能通过UPS进行降解，以及这一过程在植物生理学中的作用。
实验方法：泛素化蛋白质组学、定量蛋白质组、脂质代谢组、WB
主要结果
叶绿体内部与光合作用相关的蛋白存在广泛泛素化
为了初步了解CHLORAD的范围比以前设想的更广的可能性，作者对分离的拟南芥叶绿体进行了免疫印迹研究，为了提高分析的敏感性，使用了表达6x Myc标记的泛素(6Myc-Ub)的转基因植物系。通过抗myc分析，作者在纯化的叶绿体中检测到高分子量的条带（图A），研究者发现叶绿体内部的光合作用相关蛋白，包括由叶绿体基因编码的蛋白，可以发生泛素化。此外，这些抗myc条带在叶绿体用热溶酶(一种去除表面暴露的OEM蛋白的蛋白酶)处理后仍然存在（图B），表明泛素化蛋白可能存在于内部隔室，如内包膜(IEM)、基质或类囊体膜。基质(细胞器的主要水室)中泛素化蛋白存在的支持是通过亚分离得到的，这表明在膜和可溶性(主要是基质)部分中都存在泛素蛋白。
为了验证所观察到的条带与泛素化的叶绿体蛋白相对应，用抗myc免疫沉淀富集，并用质谱分析。鉴定了多个叶绿体内部蛋白，其中一种蛋白检测到特异性泛素化位点:基质蛋白PrfB3(肽链释放因子3)，有研究表明它在叶绿体基因表达中起作用。因此，这些数据共同支持了CHLORAD作用于叶绿体内蛋白质的假设。这表明UPS作用不仅限于细胞质，还能影响叶绿体内部的蛋白降解。
图：叶绿体内部的蛋白质被多泛素化。
泛素化蛋白质组学揭示了参与光合作用的蛋白质是泛素化的
为了更全面地了解CHLORAD的底物，作者对野生型植物中纯化的叶绿体进行进行蛋白质组学分析，试图系统地识别叶绿体中的泛素化靶点及其修饰位点。总共鉴定出40个蛋白中的57个非冗余泛素化位点。从CDC48-DN植物中纯化的叶绿体使用相同的泛素组学方法进行分析，并进行了三个独立的实验。总共鉴定出316个蛋白中的768个非冗余泛素化位点。这些结果表明叶绿体蛋白质组广泛泛素化，泛素化的叶绿体蛋白通常由CDC48加工。
对泛素化蛋白质组进行生信分析得鉴定出的假定CHLORAD底物属于各种功能类别，但在光合作用成分中具有显著的富集(图A)。关于亚细胞器定位，OEM蛋白在这组(316个蛋白中的20个)中表现良好，这与作者发表的结果一致;TOC组分(Toc159、Toc75和Toc34)、SP1和SPL2 (SP1- like2)以及FA合成酶LACS9(长链酰基辅酶a合成酶9)和通道蛋白OEP24(外质体包膜蛋白24)如预期一样存在。然而，大量的IEM、基质和类囊体蛋白也被鉴定出来，包括脂氧合酶LOX2 ;核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶加氧酶(RuBisCO)小亚基红细胞;各种代谢相关蛋白;捕光叶绿素结合蛋白(LHCPs);以及光系统亚单位，如PsaA、PsaB和PsbC(图B)。这表明泛素化是调控叶绿体蛋白质组的主要机制，特别是在光合作用方面。在推测的CHLORAD底物中，有13种叶绿体编码的蛋白具有已鉴定的泛素化位点。为了验证泛素分析的结果，使用体内泛素化实验分析了选定的蛋白质。表达flag标记的泛素(FLAG-Ub)的细胞进行免疫沉淀分析，结果表明，当通过表达CDC48-DN阻断底物反转录易位时，可检测到的泛素化量增加，这为叶绿体内部蛋白受泛素化和CDC48调控的结论提供了进一步的有力支持。
叶绿体泛素组每个蛋白有2.7个泛素化位点，表明叶绿体蛋白广泛泛素化(图C);全局泛素组每个蛋白质有1.1个位点，基于di-Gly数据的分析显示，所有多泛素连锁类型均存在于叶绿体中，基于信号整合的分布如下:Lys48 > Lys63 > Lys33 > Lys29 > Lys11 >>> Lys6/Lys27(图D)。由于K48是最丰富的连锁类型，大部分叶绿体泛素可以被认为是蛋白酶体降解的启动物，作者发现了一个假定的泛素附着的共识基序(图E)，这在以前的全球植物泛素组中没有观察到，这意味着一个特定的泛素化过程可能发生在叶绿体内部。此外，在不同的亚叶绿体区室中发现了泛素化位点，尽管跨膜结构域明显缺乏泛素化。
图：叶绿体内部的光合作用和其他蛋白质在叶绿体泛素组中占有重要地位。
定量蛋白质组学显示，CHLORAD调节多种蛋白质的水平
CHLORAD底物的一个特点是它们的稳态水平在CHLORAD抑制下增加，因此，作为对泛素分析的补充，作者寻找了CDC48抑制后过度积累的叶绿体蛋白。为此，作者对表达CDC48-DN和相应的CDC48 -野生型(WT)对照的植物进行了无标记的定量蛋白质组学分析，作者在两种基因型中共检测到1444种蛋白质，其中约27%的CDC48-DN相对于对照的水平升高(>1.5倍)，与CHLORAD靶点的预期一致(图A和B），作者还对同一株CDC48-DN和CDC48-WT植物分离的叶绿体进行了无标记的定量蛋白质组学分析，得到了相似的结果。泛素组学鉴定出来CDC48-DN中升高的蛋白包括一些与核心TOC装置无关的OEM蛋白，包括LACS9、OEP64、OEP24(一种通道蛋白)和CHUP1(叶绿体异常定位1)(调节叶绿体运动)。考虑到蛋白质组中OEM的丰富程度远低于基质和类囊体，这表明OEM蛋白质是CHLORAD的主要底物，此外，许多IEM和基质蛋白(如LOX2)也在CDC48-DN中升高。这些内部蛋白质具有一系列不同的功能，包括光合作用、叶绿素代谢和氧化应激反应。
为了验证蛋白质组学数据，作者进行了免疫印迹和共聚焦显微镜分析。使用特异性抗体分析了一些蛋白质，发现它们的水平在CDC48-DN植物中升高，正如预期的那样。在没有特异性抗体的情况下，选择的蛋白[包括LACS9和FAX1(脂肪酸输出1)]用黄色荧光蛋白(YFP)标签短暂表达，然后通过免疫印迹和显微镜分析。两种分析方法都表明，CDC48-DN细胞中的蛋白质含量升高，而后者显示，在每种情况下，积累的蛋白质都定位于叶绿体。值得注意的是，在这项蛋白质组学分析中检测到的238种蛋白质中，也含有至少一个泛素化位点，其中79种(33%)在CDC48-DN叶绿体中过度积累，这支持了它们是CHLORAD底物的观点。
此外，RNA测序(RNA-seq)分析显示，尽管存在许多实质性的CDC48在全局转录组中有依赖性变化，包括泛素相关蛋白水解基因在内，大多数编码CDC48-DN叶绿体中过度积累的蛋白质的转录本转录不上调(图D和E)。事实上，与蛋白质水平相反，CDC48-DN植物叶绿体蛋白在mRNA倾向于降低。
图：利用定量蛋白质组学方法鉴定多种CHLORAD底物
CDC48-DN的短期表达导致黄化，这与活性氧的过度积累有关，这种褪绿也表明叶绿体的形态发生了变化。为了探讨后一种可能性，作者对这些植物的叶绿体超微结构进行了评估。CDC48-DN植物的叶绿体中含有较大的质体红蛋白(图B和C)，这与氧化应激引起的光系统成分稳态破坏一致，并且比野生型叶绿体小(图D)，这可以解释幼苗的褪绿表型。此外，CDC48-DN叶绿体中含有较大的颗粒[堆叠的类囊体]，其中PSII集中;基质类囊体较少（图B、E），这些观察结果，以及显示CHLORAD选择性地作用于一系列叶绿体编码的光系统成分的数据，表明CHLORAD在调节光系统活动中起着微妙的作用。为了验证这一假设，我们在成熟的CDC48-DN和sp2突变体植物以及相应的对照植物中，通过测定电子传递速率(ETR)参数ETR(I)和ETR(II)(32)，同时测量了PSI和PSII中的能量转换（图F、I）。
叶绿体的另一个关键作用是脂质代谢，因为它们是植物中FA合成的主要部位。通过泛素组学或定量蛋白质组学，作者确定了参与FA代谢的两个叶绿体包膜蛋白FAX1和LACS9是CHLORAD的候选底物。这两种蛋白都参与FA向内质网的输出，其表达的变化影响FA和脂质稳态，表明CHLORAD在这些过程中发挥作用。为了研究这种可能性，作者比较了CDC48-DN和CDC48-WT叶片的脂质组学特征，重点研究了游离脂肪酸、甘油脂和甘油磷脂。CDC48-DN共检测到24种FA和脂质，且差异有统计学意义(Student’s t检验，P < 0.05)。作者观察到叶绿体产生的FAs减少，ER延长的FA增加，这支持了CHLORAD影响FA向内质网转运的假设。
图：CHLORAD是正常光合作用和脂质稳态所必需的
总的来说，这项研究的通过泛素化蛋白质组学得出叶绿体内部存在广泛的泛素化现象，包括叶绿体基因编码的蛋白质。鉴定了多个叶绿体内部蛋白的泛素化位点，这些蛋白参与了光合作用、脂肪酸代谢和叶绿体基因表达等过程。泛素化位点的鉴定排除了检测到的泛素化是未导入的细胞质前体蛋白的修饰可能性。又通过抑制CHLORAD途径中的CDC48定量蛋白质组学分析，发现了一系列在叶绿体内积累的蛋白，表明这些蛋白是CHLORAD途径的潜在底物。这些蛋白的功能类别多样，但特别富集在光合作用组分中，表明CHLORAD途径在调节光合作用中可能发挥重要作用。该项研究扩展了我们对UPS在细胞内作用范围的认识，特别是揭示了它在叶绿体内部的作用，这对于理解细胞如何精细调控光合作用和脂质代谢具有重要意义。
