铁死亡是一种独特的细胞死亡类型，其特点是由铁依赖性脂质过氧化引发的不平衡氧化还原稳态，半胱氨酸通常在蛋白质中发挥关键作用，通过在其还原形式和氧化形式之间动态切换来帮助维持健康的细胞环境，然而，半胱氨酸组的全球氧化还原景观如何在铁死亡时受到干扰仍未知。通过使用定量化学蛋白质组学策略，作者系统地分析了铁细胞中半胱氨酸组的动态变化，并确定了在铁死亡诱导条件下精确调节氧化还原状态的候选位点列表。
北京分子科学国家实验室等机构在《Cell Death and Differentiation》期刊发布题为"Quantitative reactive cysteinome profiling reveals a functional link between ferroptosis and proteasome-mediated degradation"的文章，报道了通过定量化学蛋白质组组学技术揭示了铁细胞中半胱氨酸的动态变化，揭示了DJ-1蛋白的第106位半胱氨酸可以作为铁死亡细胞的传感器开关，其上边的氧化修饰可显著激活细胞中的蛋白酶体系统。
研究背景
铁死亡是一种新发现的铁依赖性细胞死亡，是一种因细胞内氧化还原失衡造成的细胞死亡，其与癌症、缺血性坏死和神经退行性疾病等多种疾病密切相关。作为细胞铁死亡的主要标志，脂质氢过氧化物的积累可能与铁催化的芬顿反应相结合，导致活性氧(ROS)的产生灾难性地增加，从而对细胞成分的破坏性损伤。半胱氨酸作为维持氧化还原稳态的“枢轴”残基，具有高活性巯基侧链基团，该基团可以通过自氧化参与氧化还原反应，以保护细胞成分免受ROS的破坏。越来越多的证据表明半胱氨酸在铁死亡中起重要作用，因此，研究功能性半胱氨酸组在铁死亡过程中如何受到干扰将有助于破译这种复杂的细胞死亡途径。
技术手段
实验材料：DMSO处理的正常细胞，铁死亡诱导剂RSL3处理的铁死亡细胞，诱导铁死亡后用铁死亡抑制剂Liproxstatin-1处理的挽救细胞；
研究方法：isoTOP-ABPP(化学蛋白质组)、SILAC蛋白质组、GST-pulldown等。
研究内容
铁死亡细胞中半胱氨组的定量分析
作者进行rdTOP-ABPP实验以鉴定在铁死亡过程中受到干扰的特定半胱氨酸残基（图a），共检测到了 4000 多种半胱氨酸的反应性，在三种处理条件下获得了 IAyne 标记对 897 种半胱氨酸的定量信息（图b）。这些半胱氨酸按其数量比率聚类表明，它们形成了不同的类别，包括化学反应性增加或铁死亡时具有可逆/不可逆抑制的半胱氨酸（图c）。从 18 种蛋白质中获得了 20 种半胱氨酸的列表，这些半胱氨酸的还原状态在铁死亡时显著受损，且当细胞被利丙他汀-1 拯救时被有效逆转（图 e）。根据 GO 分析，这18种蛋白质在生物过程中富集，包括氧化/还原和细胞氧化剂解毒等（图f）。如谷胱甘肽 （GLRX）、谷胱甘肽 S-转移酶 omega 1 （GSTO1） 和磺胺多辛 1（SRXN1） 在 GSH 硫酸转移和细胞氧化还原调节中起重要作用（图 e）。
DJ-1蛋白的 C106 位点在铁死亡的调节中起关键作用
作者在鉴定的功能性半胱氨酸残基中，蛋白/核酸脱糖酶（DJ-1）中的C106引起了作者的注意，因为该蛋白是响应细胞氧化应激的重要调节因子，其异常功能与神经退行性疾病和癌症的发病机制密切相关。DJ-1是一种多功能蛋白，可以保护细胞免受氧化剂和金属等毒性诱导的死亡，该蛋白先前通过人H1299细胞系中潜在的转硫机制与铁死亡有关。DJ-1 中有三个半胱氨酸残基，其中两个，C46 和 C106，通过 rdTOP-ABPP 定量（图 a），根据作者的分析数据，DJ-1 的 C106 是一个出色的靶标。根据化学蛋白质组学分析结果，我们假设 DJ-1 可能在功能上参与通过 C106 调节铁死亡。为了确认观察到的 R (Fer) 变异不是由蛋白质表达降低引起的，作者通过定量三重二甲基标记对正常、铁死亡和挽救的细胞进行了全蛋白质组分析，结果显示这三种条件下 DJ-1 的丰度没有显著差异（图 b ）。与rdTOP-ABPP和全蛋白质组分析一致，IAyne探针只能标记和富集正常细胞和获救细胞的裂解物中的DJ-1，但不能标记和富集铁死亡细胞（图c），证实C106的化学反应性在铁死亡中受到损害。作者评估了不同形式的 DJ-1 的表达如何影响 HT1080 细胞对铁死亡的敏感性。CRISPR-Cas9敲除DJ-1可以有效地使HT1080细胞对RSL3诱导的铁死亡敏感（图d）。且对铁死亡的额外敏感性可以通过外源表达野生型(WT) DJ-1而不是C106A突变体来逆转（图d、e），与这些结果一致，DJ-1 WT 的稳定表达而非 C106A 的稳定表达显示出对 HT1080 细胞对铁死亡的深刻保护（图 f、g)，DJ-1的敲除诱导细胞中脂质ROS的显著增加，在RSL3处理后4小时达到峰值，与C106A相比，过表达DJ-1 WT可以更好地抑制脂质ROS（图h）制了脂质ROS水平的升高，而在过表达C106A突变体的细胞中几乎看不到这种影响（图i）。总的来说，这些数据表明 C106 在 DJ-1 中起着重要作用，以降低脂质 ROS 水平并抑制 RSL3 诱导的铁死亡。
DJ-1的C106通过改变与蛋白酶体的相互作用调节铁死亡
据报道，C106还与20S蛋白酶体相互作用，鉴于蛋白质稳定和蛋白质折叠在作者分析的半胱氨酸组分析中也具有功能富集，作者决定测试 DJ-1 和 20S 蛋白酶体之间的相互作用是否会在铁死亡中受到影响。作者通过免疫沉淀拉低内源性 DJ-1 的相互作用蛋白。免疫印迹表明，在铁死亡诱导条件下，它们与 DJ-1 的相互作用被显著破坏，并通过添加利普他汀-1 完全恢复（图 a-c）。作者还在 HT1080 细胞中过表达带有 N 端 FLAG 标签的 DJ-1 WT，并且 FLAG-DJ-1 的免疫沉淀概括了与内源性 DJ-1 相似的结果（图d-f ）。有趣的是，DJ-1 C106A在基础条件下与PSMB1和PSMA4（但不是PSMD1）的相互作用显著减少，在铁死亡时没有进一步减少（图g-i）。这些结果共同表明，C106 是促成 DJ-1 和 20S 蛋白酶体相互作用的主要位点之一，并且可能存在另一种不依赖 C106 的机制来调节 DJ-1 与 19S 蛋白酶体的相互作用。
此外作者还通过使用荧光标记的底物肽 Suc-LLVT-AMC测试了20S蛋白酶体的活性在铁死亡过程中是否受到影响等实验，结果均证明了DJ-1 是铁死亡过程中蛋白酶体活性的重要调节因子，其 C106 是关键的功能开关。
C106 的氧化破坏了 DJ-1 与 20S 蛋白酶体的相互作用
为了确认 DJ-1 在 C106 上的氧化，我们在 HT1080 细胞中过表达带有 N 端标志标签的 DJ-1 蛋白，在用 RSL3 处理细胞后，对 DJ-1 进行免疫沉淀，凝胶内胰蛋白酶消化并通过 LC-MS/MS 进行分析。结果检测到磺酰化是主要修饰，DJ-1 在 C106 上的磺酰化可以通过轻细胞和重细胞中的 MS/MS 光谱得到证实（图 b）。对应于细胞铁死亡时该特定半胱氨酸的磺酰化水平增加约 4 倍（图 c）。相比之下，在RSL3处理后，C53上的磺酰化水平仅略有降低（图c），表明氧化事件特异于C106发生。通过GST-pulldown也C106 的氧化完全破坏了 DJ-1 和 20 S 蛋白酶体亚基之间的相互作用（图 d）。这些结果表明，DJ-1的C106在铁死亡的过氧化环境中被磺酰化，C106的氧化导致DJ-1和20S蛋白酶体解离，从而进一步上调蛋白酶体的活性。该项工作在铁死亡和UPS系统之间建立了联系，DJ-1的功能性半胱氨酸106作为关键调节剂。
研究结论
