人类的实体癌主要分为两种组织学亚型，即鳞状细胞癌(SCCs)和腺癌(ACs)，世界范围内的发病率和死亡率居高不下。SCC是一种侵袭性恶性肿瘤，常发生于皮肤、呼吸系统、消化系统及泌尿生殖系统的复层上皮。区别于普通的SCC，罕见SCC常发生于胰腺、乳腺、甲状腺等非典型器官组织，临床上称化生型SCC，且较常见SCC有更强的转移性和侵袭性。病毒感染、吸烟或日晒等是SCC的主要诱因，SCC均有角蛋白片形成或细胞内角化的组织学特征，而这对发生转移的起源部位定位价值有限。
P63是上皮发育和维持的主要调节因子，是推荐的常见SCC的诊断标记，但是在某些肿瘤中特异性较低。除去肿瘤自身特征，肿瘤微环境(TME)的浸润性免疫细胞类型模式参与肿瘤进展和患者预后，但整体免疫状况仍不清楚。尽管癌症基因组图谱（TCGA）全面生成了SCC在头颈等五个部位的分子图谱，也从RNA分析识别出了活跃的亚组和通路，但靶向这些通路很大程度上未成功，可能的原因是这些机制不能反映功能效应，因为它们仅驻留在许多调控层。因此，由这些基因组和转录组改变形成的蛋白质组，代表了肿瘤进展和免疫细胞浸润。此前，通过理解肿瘤形成和发展的分子机制，ACs的诊断和治疗方案已经出现，而转移性SCC的诊断和晚期SCC的治疗指标很大程度上仍不清楚，这使得SCCs功能蛋白组的研究显得尤为迫切和重要。
二、技术路线
SCC组织样本共有333个，分属17个部位，AC组织样本共有69个，分属7个部位，样本均由复旦大学附属中山医院提供。
三、研究结果
1、不同部位SCC的蛋白质组学特征
为了解SCCs的蛋白质特征，对SCC原发性肿瘤的333个样本分属10个常见部位，即鼻咽，口腔，喉咙，皮肤，食管，肺，宫颈，阴茎，阴道，会阴；7个罕见部位，即甲状腺，胸腺，乳房，胰腺，胆囊，膀胱，肛门进行蛋白质定量、分析及评估，评估包括性别、年龄、肿瘤分化、角化等（图1 a、b）。17个部位SCC组织样品中有14840个蛋白质组被定量，平均每个样品的SCC蛋白组有8120个（图1 c）。对所得蛋白分析，发现在基因组研究中推荐作为SCC诊断标记的KRT5及TP63普遍高表达，而YAP1、AKT3和SOX2表现出不同程度的表达缺失，表明17个部位的SCC中信号通路的差异激活。以上结果显示本次研究得到了高质量蛋白质组数据，建立了一个系统的中国鳞状细胞癌的蛋白质组学图谱。
图1 SCCs的蛋白质组学特征
2、SCCs与ACs蛋白质组学特征比较
为了解ACs与SCCs蛋白质组学差异，对ACs（来自乳房、甲状腺、肺、胃、胰腺、胆囊和结肠）和SCCs进行差异蛋白分析，得到1538个差异表达蛋白（DEPs），分别有643个及895个蛋白在ACs和SCCs中过表达（图2 b、c）。基因集富集分析(GSEA)显示，ACs蛋白在核糖体、体液免疫反应等富集；而SCCs蛋白主要涉及角化相关通路、泛素样蛋白连接酶活性等（图2 d）。结果表明，SCCs和ACs之间的显著差异符合上皮组织的性质。对4个SCCs和5个ACs进行预后分析。富集通路ECM中的DEPs和糖代谢在两者中均表现出较差的预后，这表明无论肿瘤组织学类型如何，肿瘤代谢和微环境都可能促进肿瘤发生和发展（图2 e）。
图2 SCCs与ACs的蛋白质组学特征
3、普通SCCs与罕见SCCs蛋白质组学特征比较
为了研究病理参数如何影响蛋白质组和信号转导，对DEPs在常见与罕见、低分化与中/高分化等方面进行比较分析。主成分（PCA）分析表明在SCC的发生发展过程中存在显著的蛋白质组差异（图3a）。对333例SCCs进行临床病理特征分类，罕见SCC与较差的病理特征呈正相关（图3b）。值得注意的是，PLIN1在罕见SCC中高表达（图3e）。荧光原位杂交（FISH）检测PLIN1表达，仅在肛门SCC样本中检测到，表明PLIN1在罕见SCC中高表达的潜在机制。鉴于转录因子（TF）在肿瘤发生和侵袭中的地位，研究了普通/罕见SCC间TFs差异表达。结果显示，10个TFs在罕见SCC中过表达(如AEBP1)，33个在普通SCC中过表达(如TP73)(图3g)。为了解TF对靶基因的调控，对TF-靶基因（TG）进行富集分析，RUNX2和FOXO1在罕见SCC中过表达，调节大部分的TG（图3h）。在罕见SCC中，RUNX2、FOXO1和PLIN1可能调控着脂质代谢过程（图3 k）。这一发现预示着RUNX2、FOXO1和PLIN1可能作为罕见SCC的诊断标志。
图3 普通与罕见SCCs蛋白质组学特征
4、SCCs蛋白质组层次聚类分析如同基因组和转录组对SCCs聚类形成亚组，需要对SCCs进行蛋白质组聚类。t-SNE分析显示SCC起源组织类型相似（图4a），基于蛋白质组特征，对SCCs样本进行分层聚类，得到4个簇，显示了不同蛋白质表达和信号转导模式（图4 b）。聚类1 (EOST，以每个器官的首字母命名，按字母顺序排列)与细胞骨架功能和免疫有关，如细胞骨架蛋白结合。聚类2 (LNT)以高水平有氧氧化为特征。聚类3(BBGPT)为罕见SCC，与ACs非常相似(图2d和图4d)。聚类4 (ACPPV)均为肛门生殖器鳞状细胞癌，具有高HPV感染频率（图4 b、c）。比较4个簇的所有DEPs的预后值，发现ATM蛋白与预后良好相关，而MMP19蛋白则相反（图4e）。为了阐明SCCs起始机制，我们匹配了4个簇的所有DEPs的激酶，簇1 、簇2、簇3、簇4的特异性激酶主要分别参与免疫应答，氧化磷酸化，脂质代谢及细胞周期（图4f、g）。这4个蛋白质组簇显示了解剖特征，并可能提示SCC的差异起始。
图4 SCCs蛋白质组层次聚类分析
5、SCCs免疫景观及其潜在的药物靶点研究
为了解SCCs的免疫特征，对SCCs进行聚类，识别出6个具有明显TME特征和预后的SCC亚型（图5a、b），这些分类得到了组织病理学评估的支持（图5 c、d）。IhSq肿瘤包含鼻咽和会阴SCCs，区别于其他5个亚型，该型具有更高程度的B细胞、CD4+ T细胞和M1巨噬细胞，该亚型蛋白可上调多种免疫相关和信号通路，可能会受益于免疫治疗（图5 b）。对6个亚组肿瘤细胞上可靶向的膜蛋白进行总结，于5个亚组中发现了钠、钾等离子通道，可能作为潜在的药物靶点（图5 e）。以上结果表明，评估TME属性以进行治疗方法选择似乎是有必要的。
图5 SCCs免疫分型及潜在药物靶点图谱
6、HPV 相关SCCs蛋白质组特征
为了描述HPV对SCCs的影响,检测HPV分型，并进行蛋白质组分析。结果显示，仅肛门生殖器SCCs显示HPV阳性，HPV16是主要感染株系（图6a，b）。根据感染模式分类得到 5个组（图6c），即1组：仅HPV16感染；2组：HPV16为主的多重感染；3组：非HPV16为主的多重感染；4组：非HPV16感染的HPV感染；5组：HPV阴性。对5个组不同的通路调节模式进行富集，结果显示，HPV16阳性SCCs (1-3组)表现出较高的肌醇磷酸分解代谢过程，负调控T细胞受体和抗原受体介导的信号通路，提示其对免疫功能有抑制作用(图6d）。在肌醇磷酸分解代谢过程中，1-4组中INPP1升高，1-3组中NUDT3升高（图6e）。与非肛门生殖器SCCs相比，INPP1和IMPA2在肛门生殖器SCCs中高表达，提示HPV16感染可能导致肌醇磷酸分解代谢过程和免疫逃避(图6f)，参与HPV16阳性 SCCs的癌变。
图6 HPV 相关SCCs蛋白质组特征分析
四、结论利用蛋白质组学平台对SCC进行了系统而全面的分析,建立了一个系统的中国鳞状细胞癌的蛋白质组学图谱，增加了对SCC的新认识，提升了一个额外的层，对于更好地理解SCCs有重要的意义。
参考文献：
Song Q, Yang Y, Jiang D, Qin Z, Xu C, Wang H, Huang J, Chen L, Luo R, Zhang X, Huang Y, Xu L, Yu Z, Tan S, Deng M, Xue R, Qie J, Li K, Yin Y, Yue X, Sun X, Su J, He F, Ding C, Hou Y. Proteomic analysis reveals key differences between squamous cell carcinomas and adenocarcinomas across multiple tissues. Nat Commun. 2022 Jul 18;13(1):4167.
