冠心病(CHD)死亡率居世界首位，包括非阻塞性冠状动脉粥样硬化、不稳定型心绞痛、稳定型心绞痛和急性心肌梗死四类，同时，在中医理论中已经确立了几种典型的中医证候，如寒凝气滞(CCQS)和气滞血瘀(QSBS)等。虽然冠心病不同证型的患者分层对于中医多样化方剂的“精准治疗”是切实可行的，但迄今为止对冠心病辨证论治的科学依据知之甚少。考虑到中药方剂是根据具体症候开的，可以认为方剂所调节的分子和生物过程可能与该病证候引起的功能障碍分子和生物过程有关。因此，研究中医方剂的作用机制，有助于阐明中医辨证论治的科学依据。

图1 综合多组学和网络药理学研究不同证型冠心病生物学过程的流程图。

将患者血液样本用于代谢组学和蛋白质组学研究。通过差异蛋白质和代谢物的功能注释发现参与这两种综合征的病理过程的途径。对于这两种综合征中的每一种选取临床上用于治疗该证的3个经典中医方剂。3个方子的共同推定靶点被认为是该证的特征靶点，用于网络药理学研究和组学数据的综合分析。最后确定可能与冠心病两种综合征的发生和发展相关的关键生物学过程和分子。

1.患有CCQS或QSBS综合征的CHD患者的蛋白质组学分析

使用数据独立采集(DIA)方法共鉴定了470种蛋白质，CCQS、QSBS和HC组分别为353、355和354种蛋白质(图2A)，同时，标准样品中超过95%的定量蛋白质的变异系数(CV)低于10%(图2B)。CCQS和HC组之间有24个差异蛋白(DPs)，其中5个上调和19个下调(图2C)。在 QSBS和HC组之间总共确定了23个差异蛋白，其中9个上调和14个下调(图2D)。通过交叉分析证明7种蛋白质是两种综合征的常见DPs，17种和16种蛋白质分别是CCQS和QSBS综合征的特异性DPs(图2E)。

进一步将两种综合征的DPs构建蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络，GeneMania平台使用标签传播算法，根据其与输入列表中所有基因的链接，对整个人类基因组规模的PPI网络中的每个基因进行评分。得分较高的基因在功能上与输入基因的关联程度较高，因此它们更容易受到输入基因的影响。对于每个输入列表添加了10个其他得分最高的基因来构建PPI 网络(图2F-G)。两个PPI网络中的DPs和基因KEGG富集分析显示4组基因在胆固醇代谢通路富集，3组基因在PPAR信号通路、维生素消化吸收、脂肪消化吸收通路富集。这表明所有4种通路都参与了CCQS和QSBS综合征的疾病进程。另一方面，只有两组QSBS综合征基因富集于其他4条通路，包括互补通路和凝血级联通路。

图2 两类综合征差异蛋白(DPs)的分析。( A)每组中鉴定的蛋白质数量。( B)标准样品中蛋白质的变异系数。CCQS和HC组(C)或QSBS和HC组(D)之间的DPs火山图。( E)两个综合征的DPs之间的重叠。(F) CCQS综合征DPs的蛋白质-蛋白质相互作用网络。( G) QSBS综合征DPs的蛋白质-蛋白质相互作用网络。(H) 两种综合征DPs的KEGG通路富集分析。

对CCQS和QSBS DPs疾病组的功能注释聚类表明这两种综合征的DPs都显著富含与CHD直接相关的疾病的基因，包括炎症、心血管疾病、冠状动脉疾病和冠状动脉粥样硬化(表1)。除这些常见疾病外，CCQS的DPs还富含胰岛素抵抗、代谢综合征和2型糖尿病等疾病基因，而QSBS的DPs富含与静脉血栓栓塞、脑缺血、中风和阿尔茨海默病相关的基因。DPs丰富疾病的区别与两种综合征临床样本的合并症差异一致。

几十年来人们已经认识到，CHD与内源性或外源性脂质密切相关。胆固醇是身体通过膳食脂肪的消化和吸收产生的，血浆LDL胆固醇水平与冠心病的风险具有独立的相关性。PPAR(过氧化物酶体增殖物激活受体)由三个相关的转录因子组成：PPARA、PPARD和PPARG。它们控制过氧化物酶体的增殖，过氧化物酶体是参与脂肪酸代谢的细胞器。PPAR是脂质代谢的关键调节剂，在与CHD的发病和进展相关的生物过程中发挥作用，例如脂肪酸氧化、胰岛素敏感性和炎症信号传导。另一方面，只有QSBS的DPs在互补和凝血级联通路中富集。凝血级联反应是一组导致凝血酶产生的酶原到丝氨酸蛋白酶的转化。有人提出，血浆凝血系统的异常与缺血性中风有关，表明QSBS与缺血性卒中的相关性更强。

2.患有CCQS或QSBS综合征的CHD患者的代谢组学分析

对CCQS或QSBS综合征的CHD患者的差异代谢物(DM)进行了功能富集分析，CCQS患者血清中富集了7种不同的代谢通路，包括脂质代谢、氨基酸代谢、辅因子和维生素的代谢。QSBS患者血清中富集了10种不同的代谢通路，包括脂质代谢、氨基酸代谢、翻译、碳水化合物代谢。CCQS和QSBS 2组代谢物均富集了2条脂质代谢通路(亚油酸代谢和不饱和脂肪酸的生物合成)，以及2条氨基酸代谢通路(甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢；半胱氨酸）和蛋氨酸代谢)(图3A-F)。此外，CCQS的DMs富集了另外2条脂质代谢通路，即甘油磷脂代谢和鞘脂代谢。而QSBS的DMs富含4条氨基酸代谢途径，包括精氨酸代谢、酪氨酸代谢和2条谷氨酸代谢通路(图3G)。

CCQS和QSBS的差异代谢途径网络显示CCQS患者血清中的独特代谢物有12种，包括5种甘油磷脂、2种鞘脂、1种脂肪酰基、2种氨基酸、2种胺，QSBS患者血清中的独特代谢物有15种，包括10种氨基酸、2种脂肪酰基、1种甘油磷脂、1种苯类和1种有机酸(图4)。

图3 两种不同综合征的 CHD 患者的代谢分析。(A、B) 两种综合征的非靶向和靶向代谢组的PLS-DA评分图；(C) 从两个证候中获得的DMs的类别和比例；(D) 通过OPLS-DA模型和单变量分析过滤的DM的维恩图；(E) CCQS综合征中DMs富集的差异代谢通路；( F) QSBS综合征中DMs富集的差异代谢通路；(G) 两种综合征DM的KEGG代谢通路。

图4 DMs的差异代谢网络分析和代谢生物标志物组的诊断分析。( A) CCQS综合征中DMs 富集的差异代谢网络分析；(B) QSBS综合征DMs富集的差异代谢网络分析。

3.代谢组-蛋白质组综合分析与ROC诊断

通过构建两种综合征的综合代谢物-蛋白质网络来研究与同一综合征相关的代谢物和蛋白质之间的相互作用。CCQS网络由6种代谢物和4种蛋白质组成，而QSBS网络由11种代谢物和6种蛋白质组成。其中3种脂肪酸代谢物(花生四烯酸、亚油酸、二十碳五烯酸)和1种蛋白质(APOB)是两个网络中包含的相同代谢物和蛋白质(图5A-C)。花生四烯酸、亚油酸、二十碳五烯酸是与炎症显著相关的脂肪酸代谢物，提示炎症可能是两种综合征的共同特征。通过对两种综合征的DP和DM进行ROC诊断分析，蛋白质组学实验确定了生物标志物组(ACTA2、FCGBP、LBP、IGHM)可以准确地区分CCQS患者和健康对照组，生物标志物组(CFHR3、EFEMP1、UBA52、APOD、CAT)可以准确区分QSBS患者和健康对照。代谢组学实验确定了两种生物标志物组(L-缬氨酸、泛替硫因、lysoPC (20:2)、1-磷酸鞘氨醇和焦谷氨酸、乙酸、PC (20:1/14:1)、柠檬酸)，可以准确区分CCQS和QSBS患者与健康对照(图5D-G)。

图5 代谢组-蛋白质组综合分析与ROC诊断。(A) CCQS患者的代谢组-蛋白质组综合分析；(B) QSBS患者的代谢组-蛋白质组综合分析；(C) 两种综合征DMs和DPs的KEGG代谢通路富集分析；(D-G)不同综合征的生物标志物组的ROC诊断分析。

4.4.网络药理学与多组学结果的综合分析

通过整合网络药理学、蛋白质组学和代谢组学研究的数据，构建了两个综合征的综合代谢物-基因网络，并分别对两个网络中的分子进行了功能注释。代谢组学和蛋白质组学分析的结果表明两种综合征的在5种常见通路(甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢；不饱和脂肪酸的生物合成；亚油酸代谢；胆固醇代谢；PPAR 信号通路)上具有一致性，1个特异性CCQS的通路(泛酸和CoA生物合成)，以及QSBS的3个特定途径(D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢；丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢；乙醛酸和二羧酸代谢)。综合网络中综合征特异性基因的疾病聚类分析表明，两种综合征的基因都富含冠状动脉粥样硬化。此外，CCQS特异性和QSBS特异性基因也分别在代谢综合征和脑血管疾病中富集，其中，与CCQS综合征相关的特异性DPs是PON1和ADIPOQ，与QSBS综合征相关的特异性DPs是APOE和APOA1，表明两对DPs在这两种综合征的病理学中可能发挥重要作用。

图6 多组学数据的集成网络分析。CCQS(A)和QSBS(B)综合征的综合代谢物基因网络；(C) CCQS和QSBS综合代谢物-基因的共同通路网络；(D) CCQS的综合代谢物基因网络；(E) QSBS的综合代谢物基因网络。

图4 T2DM-DN患者进展为ESRD的风险。(a) 单变量Cox比例风险模型；(b , c) 两个多变量Cox比例风险模型；( d ) 第三个多变量Cox比例风险模型包括在第二个多变量模型中与ESRD显著相关的所有蛋白质。

通过整合临床样本、多组学研究和网络药理学，研究表明冠心病CCQS和QSBS综合征均与甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢；不饱和脂肪酸的生物合成；亚油酸代谢；胆固醇代谢；和PPAR信号通路5个通路的功能障碍有关。冠心病患者的CCQS综合征的特点是泛酸和辅酶A生物合成改变，而患有QSBS综合征的CHD患者的特点是D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢，以及乙醛酸和二羧酸代谢通路紊乱。此外，研究结果表明与CCQS综合征相关的特异性DPs是PON1和ADIPOQ，与QSBS综合征相关的特异性DPs是APOE和APOA1。本研究有助于我们从现代生物医学科学的角度认识中医证候，促进中医理论在精准医学实践中的应用。

文章链接：

https://doi.org/10.1186/s13020-021-00521-3

参考文献：

Gaosong Wu, Jing Zhao, Nixue Song, et al. Exploring biological basis of Syndrome differentiation in coronary heart disease patients with two distinct Syndromes by integrated multi-omics and network pharmacology strategy. Chinese Medicine, 2021, 16(109):1-21.

编辑丨Aaliyah

审核丨Tao Li