如今，生物降解有机废物作为应对环境挑战的解决方案受到了广泛关注。双翅目昆虫黑水虻(BSF)，尤其是其幼虫(BSFL)，具有将有机废物转化为蛋白质和脂质资源的出色能力，因此引起了人们的极大兴趣。然而，除了其回收利用效率外，BSF的基础生物学信息仍然有限。

1.BSFL中蛋白质变化分析

图1为不同龄期BSFL蛋白的分析，结果表明蛋白质含量差异不明显(30-40%)，但BSFL L1-L5b的总可溶性蛋白质含量存在差异，蛋白质含量从L1到L3逐渐增加，从L3到L5b逐渐降低，L3的蛋白质含量最高。从SDS-PAGE可观察到L1到L5b每个龄期的蛋白质分布各不相同，L1、L4、L5a、L5b在50 kD处有明显条带，L4、L5a、L5b在80 kD处有明显条带，从L2到L4的蛋白质分子量低至35 kD。然而，对于L5a和L5b，出现了分子量高于100 kD的蛋白质。研究进一步比较了L3和L5的蛋白质，并对COG数据库中的差异蛋白进行了注释(图1C)，可以推断大多数差异蛋白都参与了转录、核糖体结构和生物过程。

图1 不同龄期BSFL蛋白的分析。(A) 不同龄期BSFL的蛋白质含量；(B) 不同龄期的 BSFL 蛋白的 SDS-PAGE；(C) COG数据库中L3和L5之间的差异蛋白。

2.BSFL蛋白的功能注释

如表1TMT分析所示，研究总共检测到5036个蛋白质，COG数据库中有1331个蛋白质注释，GO数据库中有3348个蛋白质注释，KEGG数据库中有2466个蛋白质注释，在Pfam数据库中有3566个蛋白质注释，在Subcell-Location数据库中有3905个蛋白质注释，这些蛋白在COG、GO、KEGG、Pfam和Subcell-Location数据库中的比例分别为26.43、66.38、48.97、70.81和77.54%。因此，蛋白质注释的最高数量为3905，即有3905个蛋白质具有功能注释。

为获得BSFL在其所有发育阶段的蛋白质分布及其对应的功能，研究进一步进行了GO功能分析(图2)。根据细分程度分为level2、level3、level4，主要从生物过程(BP)、细胞成分(CC)和分子功能(MF)三个方面对BSFL的蛋白质进行分类注释。如图2A所示，level2下BP有10个主要过程，丰度最高的蛋白与细胞过程、代谢过程和单一生物过程有关。在level3(图2E)，大部分蛋白质在有机物代谢过程、初级代谢过程和细胞代谢过程中聚集，这意味着活跃的新陈代谢可能在BSFL的快速生长中起重要作用。图2B显示level2下的CC中，与细胞、细胞部分和细胞器相关的蛋白质数量分别为1671、1627和1166。而在MF的10个主要过程中，与结合和催化活性相关的蛋白质显着(图2C)。在level3下蛋白质与离子结合、有机环状化合物结合和杂环化合物结合有关，表明这些活动在分子水平上参与了有机循环。此外，由图2D的KEGG通路分析获得的43条通路中可观察到共有230个蛋白质参与碳水化合物代谢，158个蛋白质参与氨基酸代谢，144个蛋白质参与脂质代谢，这些蛋白质都与新陈代谢活动相关。同时，有228种蛋白质被证明参与了细胞过程中的转运和分解代谢途径，75条通路与消化系统有关。总的来看，这些蛋白质大部分都参与了生物系统中的内分泌系统和免疫系统，表明这些蛋白质在所有器官活动中在内分泌和免疫器官中最为活跃。

图2 level 2、level 3、level 4下蛋白质数量的GO分类图和BSF的KEGG分析。(A) BP下不同功能的蛋白质数量；(B) CC下不同功能的蛋白质数量；(C) MF下不同功能的蛋白质数量；(D) KEGG分析不同途径的蛋白质数量；(E) level 3的GO分类图；(F) level 4的GO分类图。

3.BSFL不同龄期差异蛋白表达分析

研究分析了从 L1、L2、L3 和L4到L5a和L5b的每个龄期BSFL的蛋白质表达，来分析每个发育阶段的差异表达和蛋白质分布。如 PCA图所示(图3A)，不同龄期的蛋白质分布不同，L1和L2在蛋白质分布上存在明显差异，这可能是由于L2的BSFL已开始食物摄入并产生代谢过程，而L1的BSFL刚刚孵化并没有开始食物摄入。由相邻龄期蛋白质谱的比较可知更多的蛋白质在L2和L5a上调和下调，与PCA分析一致(图3B-F)。进一步对BSFL生命期间三种途径(胰岛素信号、脂肪酸生物合成、toll/IMD通路)中的蛋白质变化进行研究(图3G-I)。在胰岛素信号通路中共检测到46种蛋白质，在脂肪酸生物合成通路中检测到22种蛋白质，在toll/IMD通路中检测到26种蛋白质。对于胰岛素信号通路，上调的蛋白质从L3增加到L4再减少到L5b，这一趋势对应于这一时期BSFL的增长率，并且胰岛素信号通路与昆虫生长速度密切相关。对于脂肪酸生物合成通路，大部分上调蛋白出现在L2、L3和L4，大部分下调蛋白出现在L5a和L5b，最大的变化发生在L1和L2之间，L4之后几乎没有上调的蛋白质。对于toll/IMD通路，上调蛋白和下调蛋白的数量从L4下降到L5a和L5b，这意味着在此期间toll/IMD通路中的蛋白质变化越来越小。

图3 (A) 不同龄期蛋白质的PCA分析、(B-F) 相邻龄期蛋白质谱的比较及(G-I) BSFL生命期间三种途径(胰岛素信号、脂肪酸生物合成、toll/IMD通路)中的蛋白质变化。

3.BSFL不同龄期蛋白质聚类分析

作者进一步分析了BSFL生命周期中蛋白簇的变化，以对蛋白质的变化进行分类和分析。如图4A所示，胰岛素信号通路中L1龄期的大部分蛋白质表达水平更高，相比之下，L5a和L5b的大多数蛋白质表达程度较低。从L1到L5b，15个蛋白下调，3个蛋白上调，7个蛋白质先上调后下调。另外，糖原磷酸化酶（HiOGS03358）从L1到L5b快速升高，这可能与BSFL的持续能量需求有关。糖原代谢与昆虫的生长代谢有关，糖原磷酸化酶是糖原代谢中为生长提供能量的重要蛋白质之一。糖原磷酸化酶还参与几丁质合成，随着BSFL的发育，几丁质结晶逐渐增加，与文章检测到的糖原磷酸化酶的变化一致。对于脂肪酸生物合成通路，大多数蛋白质在L1处低表达(图4B)，从L2到L4表达水平增高，表明脂肪酸生物合成在L2-L4龄期活跃。乙酰辅酶A羧化酶（HiOGS00269）和脂肪酸合酶（HiOGS07375）从L2到L4呈现高表达，在L2时最高，进一步证明了脂肪酸生物合成的活跃，因为乙酰辅酶A羧化酶和脂肪酸合酶是脂肪酸生物合成中的两个重要因素。对于toll/IMD通路，FAS相关因子1(HiOGS03357) 和核因子NF-κB抑制剂(HiOGS03357) 在幼虫生命期间减少(图4C)。FAS相关因子1和NF-κB抑制剂参与了抗菌肽的负调节。此外，NF-κB抑制剂还是toll/IMD通路和免疫反应中的关键蛋白，因此证明其对环境的免疫反应逐渐增强。

图4 三种途径的蛋白质聚类分析及蛋白质名称。(A) 胰岛素信号通路的蛋白质聚集；(B) 脂肪酸生物合成途径的蛋白质聚集；(C) 收费/IMD 通路的蛋白质聚集。

该研究分析了BSFL不同龄期的蛋白质组学差异以及三种重要通路的蛋白变化。L2、L3和L4的蛋白质之间没有明显差异，L5a和L5b的蛋白质也相似。结果显示，46个蛋白与胰岛素信号通路相关，22个蛋白与脂肪酸生物合成通路相关，26个蛋白与toll/IMD通路相关。胰岛素信号通路中的大多数蛋白质从L1到L3高表达，脂肪酸生物合成中的大多数蛋白质从L2到L4高表达。此外，toll/IMD通路中抗菌肽的负调节因子从L1减少到L5b。该研究有助于系统了解BSFL的蛋白质组学和参与不同途径的基因，为未来不同功能基因编辑提供参考。

文章链接：

https://doi.org/10.1021/acs.jproteome.0c00736

参考文献：

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J. J. A. Dietary Enrichment of Edible Insects with Omega 3 Fatty

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编辑丨zhenzhen L

审核丨Tao Li