免疫共沉淀IP洗脱方法汇总

日期:2020-02-19 16:57

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    本方法整理针对免疫共沉淀方法富集的样品,常用的方法如下:


针对常规蛋白蛋白定性检测推荐

方法一:直接电泳

1. 免疫沉淀反应后,在4 °C 以3,000 g速度离心5 min,将protein A/G-beads离心至管底;将上清小心吸去,protein A/G-beads用10 mM的Tris-Cl缓冲液洗3-4次;最后加入15 μl的2×SDS 加样缓冲液,沸水煮10 min;
2. SDS-PAGE, 考马斯亮蓝染色脱色后,切取相应胶条,胶内酶解后进行质谱分析。

针对常规蛋白定量检测方法推荐

方法二:甘氨酸洗脱

1. 用10 mM的Tris-Cl缓冲液把Beads洗3次,3,000 g速度离心5 min,尽量吸尽洗涤液;
2. 加入洗脱缓冲液(0.2 M Glycine, 0.15% NP40,pH 2.3),一般50 µL的beads 需加入75-100 µL洗脱buffer;
3. 室温震荡洗脱 10 min;
4. 2000 g离心2 min,吸取上清到新的EP管中;
5. 重复step2~4洗脱两次(若洗脱后杂带太多,可适当增加洗脱液体积或者加大原始样品蛋白量);
6. 取十分之一的洗脱样品跑胶银染检查样品洗脱情况;
7. 测定蛋白浓度,取等量蛋白进行trypsin酶解脱盐后,可进行质谱上机。 

方法3:8 M尿素洗脱

1. 用10 mM的Tris-Cl缓冲液把Beads洗3次,3,000 g速度离心5 min,尽量吸尽洗涤液;
2. 加入洗脱buffer(100 mM Tris-Cl ,8 M Urea pH8.0), buffer体积由beads量决定,一般50 µL的beads 需加入100 µL 洗脱buffer;
3. 将混合物室温震荡洗脱15 min;
4. 2000 g离心2 min,吸取上清到新的EP管中;
5. 重复2-4步骤一次;
6. 取十分之一的洗脱样品跑胶银染检查样品洗脱情况;
7. 测定蛋白浓度,取等量蛋白进行trypsin酶解脱盐后,可进行质谱上机。