冠状病毒是具有包膜的单股正链RNA病毒，SARS-CoV-2作为人类病原体出现，是冠状病毒β属中的其中一种，可在人群中导致重症并已在全球范围内传播。深入了解病毒蛋白的分子功能及其与宿主蛋白质组的相互作用对高效开发防治药物或疫苗非常重要。

1.利用A549 肺癌细胞表达目标病毒蛋白，通过亲和纯化定量数据的统计模型，随后进行质谱 (AP-MS) 分析，以确定病毒蛋白-宿主蛋白相互作用。

2.通过分析病毒对宿主细胞转录组、蛋白组、泛素化和磷酸化蛋白质组的影响以了解病毒的侵染效应。

3.分析SARS-CoV-2 和 SARS-CoV 病毒蛋白的磷酸化和泛素化修饰水平以了解病毒干扰细胞信号传导的机制。

4.利用生信分析手段揭示病毒蛋白质的宿主靶标与下游蛋白质组变化之间的功能联系。

5.在已获得的数据和研究结果的基础上，确定识别 SARS-CoV-2 靶向的通路并进行药理学实验，筛选出抗病毒效果良好的药物。

1. 病毒蛋白-宿主蛋白间的互作分析

将表达单个血凝素标记病毒蛋白的慢病毒导入A 549肺癌细胞，并通过亲和纯化和质谱分析共确定了1086种细胞蛋白与24种SARS-CoV-2和27种SARS-CoV诱饵蛋白之间的相互作用。其中，SARS-CoV-2和SARS-CoV的特异性互作蛋白分别有293和169个（图1）。此外，对表达54种病毒蛋白的A 549细胞的总蛋白组进行研究，发现两种病毒的ORF9b都可导致线粒体调控失调。另外，载脂蛋白B(apolipoprotein B，APOB)受SARS-CoV-2的ORF 3和NSP 1的调控，提示其在SARS-CoV-2生物学中具有重要的作用。

图1 (a) 以人冠状病毒(HCoV-NL63和HCoV-229E)的3个同系物(HCoV-NL63和HCoV-229E)为参照，系统比较了24种SARS-CoV-2和27种SARS-CoV病毒蛋白之间的差异和宿主蛋白质组的变化。(b) SARS-CoV-2与SARS-CoV-2和SARS-CoV的病毒-宿主蛋白-相互作用网络。(c) SARS-CoV-2 和 SARS-CoV 同源蛋白之间独特和共享的宿主相互作用的数量。

2. 病毒感染的多组学特征分析

用SARS-CoV-2和SARS-CoV分别感染A549肺癌细胞，随后以时间分辨的方式分析了病毒感染对宿主细胞mRNA表达、蛋白质丰度、泛素化和磷酸化修饰蛋白质组的影响，目的是为了直接研究单个病毒蛋白在病毒感染背景下的联合活性。研究发现SARS-CoV-2和SARS-CoV均能下调I型干扰素反应，并在转录组和蛋白质组水平上激活促炎信号。SARS-CoV能激活NF-kB通路，而SARS-CoV-2感染可导致FN1和SERPINE 1的高表达，这可能与转化生长因子-β因子的特异性募集有关，这一结果支持了SARS-CoV-2对转化生长因子TGF-β信号的调控作用。

对感染SARS-CoV-2和SARS-CoV后的A549肺癌细胞进行了蛋白质泛素化和磷酸化分析，目的是为了更好地了解细胞信号干扰的机制。结果表明，在检测到的16541个泛素化位点中，有1108个受SARS-CoV-2或SARS-CoV感染的影响。此外，SARS-CoV-2还特异性地增加了自噬相关因子(MAP1LC3A、GABARAP、VPS33A 和 VAMP8)以及 EGFR 上的特定位点(例如 K739、K754 和 K970)的泛素化。研究还揭示了磷酸化和泛素化模式在单个宿主蛋白上的相互作用，如波形蛋白是冠状病毒进入的中心辅助因子，在感染的早期或晚期出现明显的不同的磷酸化和泛素化模式（图2）。

图2 在不同时间点感染SARS-CoV-2 和 SARS-CoV 后宿主的多组学响应情况。

3. 病毒蛋白的翻译后修饰

相互作用数据中鉴定到了几种宿主E3连接酶和去泛素化酶，表明了泛素化与病毒蛋白功能之间存在串扰（图1b）。两种病毒(K97、K528、K825、K835、K921和K947)的S蛋白上广泛的泛素化事件，这些泛素化事件分布在功能域(N末端结构域、C末端结构域(CTD)、融合肽和七肽重复1结构域)上，潜在地表明了两种病毒之间保守的关键调节功能。此外，CAMK4和MAPKAPK2可能分别磷酸化S和N上的位点。细胞蛋白的磷酸化表明这些激酶的活性在感染新型冠状病毒或SARS-CoV的细胞中富集。研究还发现了位于病毒蛋白功能域的新的翻译后修饰位点，在SARS-CoV-2NK 338上检测到泛素化，并在SARS-CoV-2和SARS-CoV N S 310和S 311上检测到磷酸化，将这些位点映射到CTD的原子结构突出了蛋白质功能的关键位置（图3）。总之，虽然鉴别不同调控位点可能表明病特异性功能，但来自保守翻译后修饰的见解也可能为靶向泛抗病毒疗法的发展提供有用的知识。

图3 SARS-CoV-2和SARS-CoV病毒蛋白的磷酸化和泛素化。

4. 病毒对细胞关键通路的干扰

富集分析表明了两种病毒在多个层次上很大程度地扰乱了相同的细胞过程。为了进一步了解SARS-CoV-2和SARS-CoV如何影响宿主，研究者们利用自动化的方法系统地探索病毒相互作用体和效应组数据中包含的潜在分子机制。结果表明，ORF 3蛋白特异性地抑制了SARS-CoV-2自噬能通量，导致自噬受体的积累，并与SARS-CoV-2感染细胞中MAP1LC3B蛋白的积累一致。APOB（一种通过自噬降解的蛋白质）的丰度在 SARS-CoV-2 感染或 SARS-CoV-2 ORF3 表达后选择性增加，而累积 APOB 水平可能会增加动脉血栓形成的风险，这是导致 COVID-1940 患者肺、心和肾衰竭的主要并发症之一。此外，在转录和蛋白质组水平上观察到的干扰素 (IFN)-α 和 IFN-β 反应的抑制表明了SARS-CoV-2 的多种蛋白质参与了破坏 抗病毒免疫，通过进一步的实验在功能上证实了ORF 3、ORF 6、ORF7a、ORF7b和ORF9b(扩展数据图)对IFN-α和IFN-β诱导或信号转导的抑制作用。结果还揭示了ORF 8和ORF 3蛋白与TGF-β-相关因子的结合、细胞外基质调节因子(fERMT 2和cdh 1)的差异表达与病毒诱导的纤维蛋白原(fga、fgb)、纤维连接蛋白(Fn1)和SERPINE 1上调之间的联系。还观察到了TGF-β 和 EGFR 信号传导通过整合素信号传导和 YAP 依赖性转录激活 42 增强，这在 SARS-CoV-2 感染后以时间依赖性方式受到调节，在促进病毒复制的同时，这些途径的激活也与纤维化有关，这是 COVID-1916 的标志之一，图4。

图4 (a) 利用网络扩散法确定病毒蛋白的宿主目标与下游蛋白质组变化之间的功能联系,网络扩散的结果是与SARS冠状病毒感染的组学数据集相结合，以简化确定受影响的宿主途径; (b)连接SARS-CoV-2ORF 3宿主靶标与自噬因子的网络扩散子网络,有向边的厚度与随机游动转移概率成正比,黑边表示ReactomeFI中存在的连接; (c) 综述SARS-CoV-2对宿主细胞自噬的干扰作用。SARS-CoV-2ORF 3和nsp 6的网络扩散模型推导出该通路的调控机制，并与SARS-CoV-2感染引起的蛋白质水平、泛素化(Ubi)和磷酸化(Pho)的变化有关。FC: 折叠变化，PM: 质膜。

5. 引导新冠病毒治疗药物的测试和筛选

前期的研究确定了使用特征良好的选择性抗病毒药物靶向SARS-CoV和SARS-CoV-2的潜在点。为了检验抗病毒效果，研究者们针对可调节受病毒干扰的通路选择了相应的48种药物进行测试以了解它们对SARS-CoV-2 复制的影响。结果表明，gilteritinib（一种指定的 FLT3 和 AXL 抑制剂）、ipatasertib（一种 AKT 抑制剂）、prinomastat 和 marimastat（基质金属蛋白酶（MMP）抑制剂）的抗病毒活性最高，这些化合物极大地抑制了 SARS-CoV-2 的复制，同时对细胞生长没有影响或影响很小。此外，MMP2 和 MMP9 的特异性抑制剂 prinomastat 和 marimastat 对 SARS-CoV-2 显示出选择性活性，但对 SARS-CoV 没有选择性，图5。

图5 使用多组学分析方法识别 SARS-CoV-2 靶向的通路，并针对病毒作用途径的抑制药物进行筛选

结论：

    研究者们通过对病毒侵染细胞的过程进行多层次蛋白质组学分析，了解了病毒-宿主相互作用的反应过程，分析SARS-CoV-2和SARS-CoV的相互作用以及它们对肺源性人类细胞系的转录组、蛋白质组、泛素化组和磷蛋白组的影响，由此确定了SARS-CoV-2的致病特性以及冠状病毒的潜在药物靶点，并据此引导候选药物的开发，这对抑制SARS-CoV-2传播和其他冠状病毒防治具有重大意义。

连接：https://www.nature.com/articles/s41586-021-03493-4